一、目的要求：簡要介紹石蠟切片的制作和蘇木精、 曙紅染色法(簡稱H.E染色法)，

　　借以了解石蠟切片制作的基本原理和一般方法。

　　二、實(shí)驗(yàn)用具：解剖器一套、單面刀片、切片刀、切片機(jī)、載玻片、蓋玻片、標(biāo)本瓶、燒杯、量筒、漏斗、染色缸、樹膠瓶、酒精燈、毛筆、繪圖紙、濾紙、熔蠟箱(或恒溫箱)、展片臺(或燙板)、小木塊、蠟帶盒、烤片盒、切片托盤。

　　三、實(shí)驗(yàn)材料：蛙或小白鼠。

　　四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

　　(一)藥品：

　　1、70%、80%、90%、95%酒精及*：

　　95%以下的各級濃度酒精是用95%酒精加 蒸餾 水稀釋而成。簡單的稀釋方法：所需稀釋的濃度是多少，就量取多少毫升原濃度的酒精，再加 蒸餾 水至該酒精的原濃度即可。例如，配制70%酒精，就量取70ml95%酒精，然后加入25ml蒸餾水即成。

　　2、固定液：

　　常用的固定液有10%福爾馬林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在組織學(xué)切片技術(shù)方面應(yīng)用甚廣，配方如下：

　　苦味酸飽和水溶液 75ml

　　福爾馬林 　　 25ml

　　冰醋酸 　　 5ml

　　3、蛋白甘油：

　　蛋白甘油是粘貼蠟片用的粘片劑。配方如下：取一新鮮雞蛋的蛋白，充分?jǐn)嚢璩裳┗钆菽?，然后濾去泡沫，加入等量甘油，使用磁力攪拌器攪拌均勻，再加入一小粒麝香草酚防腐。因甘油粘度較大 所以須用大功率的磁力攪拌器。梅穎浦的96-1大功率磁力攪拌器非合適本實(shí)驗(yàn)。

　　4、染色液：

　　以H.E.染色法為例，需配制蘇木精染液和曙紅染液。

　?、拧⑻K木精染液：蘇木精是一種堿性染料，它可將染色質(zhì)染成藍(lán)紫色。配方有多種，現(xiàn)介紹Harris氏蘇木精的配制：

　　甲液： 蘇木精 　 　 0.5 g

　　95%酒精 　　　 5.0 ml

　　乙液： 硫酸鋁鉀(或硫酸鋁銨) 10g

　　蒸餾水 　　　 100 ml

　　　　　　0.25g

　　冰醋酸 　　　　幾滴

　　先將甲液溶解，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中，并加熱使溶解，然后將兩液混合煮沸，離開火焰后緩緩加入。冷卻后過濾，加入幾滴冰醋酸即成。

　?、啤?.5%曙紅酒精溶液：即0.5g曙紅溶于100ml95%酒精中。 曙紅是一種酸性染料，它可使多種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色或紅色。

　　5、鹽酸酒精：

　　鹽酸酒精用于分色。配制方法是在100ml70%酒精中加入1ml鹽酸。

　　6、其它：

　　二甲苯、切片石蠟、中性樹膠等。

　　(二)、操作步驟：

　　進(jìn)行組織學(xué)研究，必須把活的組織或器官制作成切片標(biāo)本，以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察。切片標(biāo)本也就是利用組織的不同結(jié)構(gòu)，經(jīng)過染色后呈現(xiàn)出不同的顏色和不同的折光率而制作的。制片的方法眾多，但基本要求是盡量保持結(jié)構(gòu)的真相，切成薄的切片，應(yīng)用不同的染色方法，使內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰易見。

　　石蠟切片法是zui常用的一種制片法。其制作過程是：取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→脫蠟→復(fù)水→染色→脫水→透明→封藏?，F(xiàn)分述如下：

　　1、取材和固定：

　　固定的目的在于保存組織內(nèi)細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，使其與生活時(shí)相似，因此要求固定的材料越新鮮越好。把動(dòng)物殺死后應(yīng)立即割取組織塊，并快速投入固定液中。

　　將蛙或小白鼠快速剪去頭部，打開腹腔，用銳利的刀片割取小塊組織(肝、腸等)。 組織塊的大小以厚度不超過5mm 為宜。 然后， 將取下的組織塊迅速投入Bouin氏固定液中。固定時(shí)間為數(shù)小時(shí)至24小時(shí)(需視組織塊的大小而定)。

　　2、沖洗：

　　經(jīng)固定的材料，可根據(jù)不同的固定液，分別用水或酒精沖洗，以洗去固定液，否則固定液留在組織會(huì)有礙染色.

　　用Bouin氏液固定的材料,可直接移入70%酒精中，多換幾次酒精，直至無黃色時(shí)為止。也可在酒精中加入幾滴氨水或飽和碳酸鋰溶液，以迅速洗去黃色。但留少許黃色也無妨礙。

　　浸洗后的材料若暫時(shí)不制片，可保存于70%酒精中。

　　3、脫水：

　　柔軟并含有多量水分的組織是易切成薄片的，故必須增加組織的硬度。石蠟切片法就是使石蠟滲入組織，以達(dá)到支持增硬的作用。但水與石蠟是不相混合的，因此，在浸蠟、包埋前須將組織中的水分*除去，這一步驟即為脫水。

　　常用的脫水劑是酒精。脫水時(shí)，先從低濃度的酒精開始，然后，遞增濃度，直至*。具體方法是，將材料經(jīng)70%酒精→80%酒精→95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ)，各級酒精1-2小時(shí)。脫水應(yīng)*，否則材料不能透明，影響石蠟的浸入，致使難以切片。

　　4、透明：

　　酒精與石蠟不能混和，因此，脫水后的材料在浸蠟前，還必須經(jīng)過透明。透明劑既可替代組織中的酒精，又能溶解石蠟，以利石蠟的滲入。二甲苯是常用的一種透明劑。

　　將脫水后的材料經(jīng)1：1*與二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各級時(shí)間為0.5-2小時(shí)，務(wù)使組織達(dá)到透明為止。

　　5、浸蠟：

　　將已透明的材料移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬即為浸蠟。其目的是去除組織中的透明劑，而使石蠟滲入整個(gè)組織，獲得一定的硬度和韌度，以便切成薄的切片。

　　先將裝有56-58℃石蠟的三個(gè)蠟杯放在熔蠟箱內(nèi)熔化，并使熔蠟箱的溫度保持恒定(約58℃)，切勿太高或太低。 然后將透明了的材料放入蠟杯(Ⅰ)→蠟杯(Ⅱ)→蠟杯(Ⅲ)。浸蠟時(shí)間視材料大小而定，一般總的浸蠟時(shí)間為2-4小時(shí)左右。

　　6、包埋：

　　將浸蠟后的材料包埋于石蠟中，并使它凝固成蠟塊，這一過程稱為包埋。

　　包埋前，視組織塊的大小先將繪圖紙折成一紙盒，作為包埋的容器。紙盒折法如下：先折1、2線，次折3、4線，然后使a、b兩折重疊，向外折出5線;同法折出6線，再折c線。zui后依同法折出7、8線及d線即成。

　　將紙盒盛滿已熔化的石蠟，隨即將第三杯中已浸蠟的材料放入其中，應(yīng)注意切面朝下，位置放正。然后速將紙盒半浸于冷水中，待石蠟表面凝結(jié)后，將紙盒全部浸入水中冷卻。石蠟全部凝固后，拆去紙盒即成蠟塊。

　　7、切片：

　　切片前，先將蠟塊用刀片修整成上下兩邊平行的正方形或長方形，否則切出的

　　蠟帶彎曲不直，或無法連成帶狀。

　　將修整后的蠟塊粘在小木塊上，小木塊裝在切片機(jī)上，以待切片。

　　在旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上將蠟塊切成4-8um厚的薄片。切下的薄片連。蠟帶。用毛筆輕輕取下蠟帶，放在蠟帶盒內(nèi)備用。

　　8、貼片或烤片：

　　將蠟片粘貼在載玻片上即為貼片。用小玻棒蘸取一點(diǎn)蛋白甘油滴于一干凈的載玻片上，用手指涂勻，并加幾滴蒸餾水于載玻片上。 將蠟帶按要求切成適當(dāng)長度的蠟片，然后用小鑷子將蠟片輕放在載玻片的水面上，再把載玻片放在展片臺上(溫度為45℃左右)。蠟片受熱后即慢慢展平。待*展平后，用解剖針將切片位置撥正，傾去載玻片上的余水后，將其放在烤片盒中，置于50℃左右 恒溫箱 內(nèi)烤干。

　　9、染色：

　　染色劑多為水溶液，故染色前必須先經(jīng)脫蠟、復(fù)水等步驟。染色方法眾多，以H.E.染色法而言有下列步驟：

　　⑴、脫蠟：將烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中，各為5min， 以溶去切片上的石蠟。

　?、啤?fù)水：是將脫蠟后的切片經(jīng)各級濃度酒精逐漸下降到水的過程，即將二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入*→95%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸餾水，各級中停留1-5min。

　?、恰⑷旧?/p>

　?、?、將蒸餾水洗滌后的切片移入Harris蘇木精液中5-10min，使細(xì)胞核著色。

　　②、用自來水洗去切片上殘余的染液。

　?、?、用1%鹽酸酒精分色數(shù)分鐘。分色時(shí)就是褪去細(xì)胞質(zhì)不應(yīng)著色部分的顏色，而使細(xì)胞核著色得清晰適度。分色時(shí)需隨時(shí)用顯微鏡檢查切片，使分色適度。

　　④、入1%氨水或自來水浸洗，使之藍(lán)化。

　?、?、在蒸餾水中浸片刻。

　?、?、切片入70%→80%→90%各1-2min。

　?、?、入0。5%曙紅酒精溶液中染色2-5min，使細(xì)胞質(zhì)著色。

　　10、脫水：

　　切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ)，各級中停留1-5min。

　　11、透明：

　　切片入1：1*、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各級停留1-5min。

　　12、封藏：

　　將切片從二甲苯(Ⅱ)中取出，用紙或布擦去材料周圍的二甲苯。在材料中央滴一小滴樹膠，然后，用鑷子加蓋蓋玻片。

　　切片封好后，放在切片托盤上待干燥，即可用不觀察。

　　染色結(jié)果：細(xì)胞核呈現(xiàn)鮮艷的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)呈粉紅至紅色。

　　(三)、注意事項(xiàng)：

　　1、制片是一個(gè)連續(xù)的操作過程，往往要連續(xù)幾天才能完成，因此，事先一定要制訂工作日程計(jì)劃，應(yīng)按順序進(jìn)行工作。這樣可避免和其它工作發(fā)生沖突，也不會(huì)因前后順序顛到或超過了規(guī)定的時(shí)間，給工作帶來不必要的損失。

　　2、制片的各個(gè)步驟都是互相關(guān)聯(lián)的，如脫水不*就會(huì)影響到透明的程度，以至影響蠟塊的質(zhì)量。為此，必須對任何一個(gè)步驟，都要細(xì)致、嚴(yán)格進(jìn)行操作。

　　3、通過本實(shí)驗(yàn)可了解到每張切片都是來之不易的，因此，應(yīng)倍加愛護(hù)，不要損壞。